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    流式細胞術疑難解答

    更新時間:2021-12-11 熱度:°

    信號弱

    如果抗體染色信號弱或無信號,可能是由于以下原因引起的:

    1、抗體儲存

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    確保你的抗體保存在4℃并且避光。如果抗體結合了熒光素,那么千萬不要冷凍保存,因為這可能會導致熒光抗體的沉淀和聚集。還有,要確??贵w沒有過期。

     

    2、稀釋

    你是不是一直在用廠家推薦的量做實驗?你可能需要進行抗體滴定找到最佳抗體用量。

    詳見:

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html

     

    3、儀器--濾光片設置

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    確保流式機器配置有合適的、能夠檢測到你所用熒光的激光和濾光片。例如Brilliant Violet™ 570需要紫光激光器和585/42的濾光片,如果你用了525/50濾光片,那么就檢測不到信號了。

    不同熒光有不同的發射譜,為了檢測到信號,需要配置有能夠捕捉到該波長信號的濾光片。在上面的例子中,525/50濾光片只能捕捉500~550nm的信號,而BV570的峰值波長在570nm,超出了范圍,故無法被該濾光片檢測到。

    還有需要了解每根激光有多少個光電倍增管(PMT),如果紫光激光器只有3個PMT,那么你想檢測4色就不可能了。

     

    4、儀器--激光性能

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    如果流式細胞儀的激光沒有很好的校準,那么就可能導致某些通道(或所有通道)信號弱。使用一些校準微球可以很方便地檢查儀器性能。所以記得按照流式細胞儀廠家的指導定期進行質量控制和優化檢查。

     

     

    5、抗原表達--表達密度

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    某些抗原本身就表達非常弱,或者只有非常少的細胞群體表達,此時,表達弱就是正常的??梢試L試選擇強的熒光素或選擇SI值高的抗體(參見:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html)

     

    6、抗原表達--細胞特異性

     

    有些單倍型特異性標記只表達在某些系別的小鼠上,所以購買抗體前需要詳細閱讀抗體說明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。

    而且,流式細胞術基于逐級設門,如果門一開始設錯了,也可能影響最后的分析結果,導致假性弱表達。

     

    7、抗原表達--表達位置

     

    要知道,有些抗原表達在細胞表面、有些表達在胞漿、細胞器內、胞核,甚至有些所有部位都表達。所以需要采用合適的方法學去檢測。

     

    8、抗原表達--誘導

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    有些抗原在活化后發生下調,而有些標記和細胞因子則需要誘導才能表達(參見:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html),如果你不經過誘導就檢測這些標記或細胞因子,就會出問題。

     

    9、緩沖液

    你實驗使用的緩沖液是否正確?例如Biolegend的FoxP3在他們自家的foxP3緩沖液中性能良好,但如果換了其它家的緩沖液,可能就檢測不出來了。同樣,其它廠家大多也是如此。固定和破膜緩沖液也十分重要。

     

    10、二抗

     

    如果你一抗用了純化或生物素標記的抗體,那么二抗是否用了正確的抗體?例如一抗用了Rat Anti-mouse,那么你的二抗應該用Goat Anti-Rat,同時應該用只加二抗的管子作為空白對照檢測背景熒光。

    還有,你應該檢測一下二抗是否還會跟其它一抗發生反應,這有助于發現是一抗還是二抗的問題。

     

     

    11、固定

    你是否在染色前固定或破膜了?固定和破膜能夠改變抗原表位和抗體的相互作用,這種敏感性是抗原依賴性和克隆依賴性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)這幾個表位通常在去污劑或甲醇處理后是不穩定的。而有些抗原位點則需要固定后才能與抗體結合而被檢測到,例如核內抗原PCNA和Ki67。

    此外,固定時間不能太長,否則容易導致交聯反應而影響熒光素的化學特性或增加自發熒光。

     

     

    12、貼壁細胞和受體

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    如果你在檢測貼壁細胞,使用的是胰酶消化,那么需要注意胰酶可能會影響一些表面標記的表達。類似的現象也會發生在膠原酶消化后。

     

    13、噪音和背景信號

    PMT的背景信號和噪音高也會導致信號弱,這可能是由于激光源的散射光、其它熒光素的滲漏或自發熒光過強等原因引起。

     

    14、熒光滲漏

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    熒光滲漏是多色流式時檢測信號出問題最常見的問題所在。所以,正確的補償非常重要。

    關于補償,請參見帖子:

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html

    https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html

     

     

     

     

    背景熒光強/非特異性染色明顯

    背景熒光高(即非特異性染色明顯)可能是多種因素造成,例如熒光素、抗體、標記方法、儀器、其它試劑或數據分析等。在此,我們對這些因素進行一一解析,讓大家能夠充分了解背景熒光的來源,從而能夠在實驗中針對性的去解決。

     

    1、自發熒光

    不同細胞和組織,以及培養基添加物,都有不同水平的自發熒光。自發熒光主要的來源包括NADH、核黃素、黃素輔酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交聯、某種生物結構(如線粒體、溶酶體等)。粒系細胞特別容易出現自發熒光,因為這些細胞內的蛋白和分子更容易在低波長時被激發(例如紫外、紫光和藍光),發射波長大約在500~700nm,與一些常見的熒光素(如FITC、PE)重疊。所以對這類細胞應該記得用未染色的空白對照檢查一下自發熒光水平。

     

    另外切記,直方圖上看不出自發熒光群,只有通過散點圖才能看出自發熒光群體并將它圈出,如下圖中所示FL-1(GFP)和FL-2散點圖查看GFP表達細胞,直方圖看到兩個峰,但無法區分自發熒光,而散點圖則可輕松圈出自發熒光群體(AF)。

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    2、稀釋

    抗體用量是否合適?盡管廠家會有推薦的抗體用量,但要記得使用前進行抗體滴定,以了解最佳用量。優化后的抗體用量可以幫助你最大程度地減少背景熒光并提高信噪比。

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    3、補償高

    如果兩個或更多的熒光素之間發射譜重疊,那么就需要調節補償以消除相互間的影響。不過,調節補償前,首先需要電壓值調節到合適的值,否則會導致補償異常增大。例如下圖中,BV510™和BV570™之間由于相互滲漏存在補償,如果BV570™的電壓被BV510™的電壓明顯高,那么會導致補償過大(下圖左側),如果PMT電壓調節到合適值,那么他們的補償就非常好調了(下圖右側)。

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    所以,有時候你的背景熒光高很可能是由于電壓沒有調好的問題。

     

    4、代謝活化

    背景熒光增高也可能由于代謝活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A時,從FMO對照中明顯看出BV421™通道基線的上升,這可能由多個因素引起,包括自發熒光增高和其它熒光素的滲漏增大引起。

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    5、花青素染料

    花青素染料和一些相關串聯染料很容易結合到Fc受體,尤其是單核細胞。這種反應無法通過Fc受體阻斷劑阻斷,其確切原因未知。如果你在研究髓系細胞中的一個群體,建議還是用其它類別的熒光素。

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    6、細胞碎片

    你有沒有用活性染料來確保分析時都能分析到活細胞?細胞碎片、死細胞可導致高背景染色,所以在設門時,切記要排除掉碎片。一般情況下,碎片在FSC/SSC散點圖中位于最左下方(如下圖)。

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    7、活性

    如果分析時不小心設門將死細胞/碎片圈進了,就可能會出現一些假陽性。所以用PI或7-AAD甚至一些更好的活性染料,能夠很好的排除死細胞(關于活性染料,我們之前發過一篇相關文章:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4124-1-1.html)。

    DAPI也可以用來區分死/活細胞,它也能夠透過活細胞膜,但效率很低。下圖顯示了DAPI+細胞群和DAPI-細胞群之間CD45/CD11b散點圖的區別。

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    8、Fc阻斷

    Fc受體表達在很多細胞表面,包括粒細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。它們很容易結合抗體的Fc部分,從而導致結果假陽性。為了這種背景熒光,推薦使用商品化的Fc受體阻斷劑或相應物種的血清。

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    9、FMO/同型對照

    同型對照是為了幫助確定目的抗體非特異性背景染色(針對Fc受體或胞內蛋白結合)而設置的陰性對照。FMO(熒光扣從對照)相對來說在抗原表達弱、或者進行多色流式實驗的時候更適合,它可以反映你的抗體組合中其它通道熒光的滲漏,幫助你選擇正確的陽性群體。

    如果你要使用同型對照,記得一定要選擇與目的抗體相同量的同型抗體。例如你使用1ug CD4,那么就要使用1ug同型對照。

     

    避免從不同公司購買同型和目的抗體,因為不同的公司,其抗體熒光素:蛋白(F:P)比例是不同的。

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    10、粘連體

    粘連體通常發生在細胞之間粘附在一起或分裂過程中。粘連體給流式細胞術分析帶來了困難,因為粘連體通過檢測點時,檢測裝置仍然認為它是一個信號。所以如果沒有在分析時設門排除掉粘連體,那么就可能對結果造成誤讀。

    在流式緩沖液中加入EDTA,并且將標本通過30um過濾,可以使粘連體大大減少。

    粘連體還可以通過散點圖的W/H或W/A設門排除。如下圖,(1)代表單個細胞群,(2)代表粘連體,兩種群體的結果明顯不同。

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    11、串聯染料降解

    如果你使用的是串聯染料,那么如果抗體保存不當或者沒有避光,那么就可能發生降解。在下圖的例子中,左圖是正常的PE-cy5檢測結果,可以看到FL2沒有信號,但PE-cy5染料在光照后降解,右側圖就可以明顯看到FL2(PE通道)也能檢測到很強的信號。

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    串聯染料對某些固定方式也很敏感,所以如果在固定后檢測發現背景熒光異常,那時也需要考慮是否由于固定劑引起。



     

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